Позднее катакомбы стали использоваться для захоронения первых христиан. В большинстве своем это были мученики, погибшие за веру. Усопших хоронили в специальных нишах, после чего над телом читались молитвы, проводились богослужения. Предположительно, именно оттуда пошли литургии и отпевания. Все погребальные помещения соединены между собой длинными галереями. Со временем катакомбы стали не просто захоронениями отдельных людей, а целыми фамильными склепами. Вплоть до V века они перестраивались и расширялись, соединяясь между собой многочисленными ответвлениями, образуя ветвистый некрополь.
С конца V-го – начала VI-го века катакомбы утратили свое назначение кладбища и приобрели статус святого места, куда ежегодно отправлялись паломники со всего света, чтобы приложиться к мощам мучеников, некоторые из которых к тому времени были канонизированы. Но после перенесения останков с мест захоронения по церквям интерес к катакомбам значительно угас. К VII веку подземный римский некрополь был заброшен и забыт.
О нем вспомнили спустя почти тысячу лет, в XVI веке на перекрытия катакомб случайно наткнулись рабочие. Попытки описать древние захоронения предпринимались в 1598 году, но лишь в XIX веке началось их детальное изучение. Кроме описи оставшихся не извлеченными погребений подробно изучалась живопись, рисунки-сценки библейской тематики. Археологами были открыты новые, ранее не известные участки галерей.
Этот колоссальный труд дал возможность ученым и теологам получить представление об искусстве первых христиан, погребальных обрядах, одежде и некоторых атрибутах, доставшихся новой вере от язычества. В частности, в склепах находили различные сосуды, драгоценные украшения и монеты. Было установлено, что захоронения были различной формы. Большинство из них имели вид обычных ниш прямоугольной формы. Некоторые имели форму аркосолии – сводчатой арки, под которой хоронили усопших. Кубикулы представляли собой парные ниши, которые располагались одна над другой по обеим сторонам коридора. А самыми редкими были захоронения в саркофагах – наиболее дорогостоящем варианте погребения.
В настоящее время для экскурсий открыта лишь часть из существующих катакомб. В сопровождении гида экскурсионные группы спускаются в древние подземелья, слушая рассказы о культуре и истории древнего некрополя.